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蛋白纯化实验常见问题精华解析
双击自动滚屏 发布者:admin 发布时间:2017-3-6 10:16:37 阅读:534次 【字体:

我现在手头有个融合蛋白,纯化的时候用助溶剂溶解后做了GST亲和层析,之后用蛋白酶切割后却发现目的蛋白没有活性。 请问有哪些可能会出现这种原因?怎么解决?测过基因序列,没有问题。细胞破碎后,融合蛋白在沉淀里,我用助溶剂提取后,可以用GST做亲和层析,但效率只有5060%左右。洗脱完融合蛋白不需要助溶剂,但这样的条件下切割完后目的蛋白会沉淀,我用0.5CHAPS助溶可勉强溶解部分,目的蛋白疏水性比较强。  
既然是疏水性很强你可以加点甘油或者乙二醇降低极性,这样溶解就会好得多,此外你也直接加2%PEG这样也降低极性,同时保护你的蛋白,你再做纯化就可以了,我以前遇到这样的蛋白是用10%的乙醇加3-5%PEG5000,这样的情况下蛋白还是活性回收率很高,我觉得那些表面活性剂能不用还是不用的好,你失去活性你可以监测一下提取,纯化,酶切到底哪里失去了活性,这样更容易解决你的问题。还有注意缓冲液PH值,看看改变它对溶解度有没有影响。蛋白有沉淀那你可以稍微把蛋白的浓度降低点,这也是个办法。
2)
请问楼主有没有合成过配体为FMN的亲和胶? 

我已经给你发了相关一些偶联的材料,请查收,现在一般要自己合成亲和填料,有很多公司都提供活化好的介质,自己偶联就可以,其中比较常用的有溴化氰琼脂糖凝胶,环氧琼脂糖凝胶,氨基琼脂糖凝胶,羧基琼脂糖凝胶,活化酯琼脂糖凝胶,以及巯基琼脂糖凝胶等,但是如果是小分子的配基最好选择有3-10碳作为手臂的活化介质为好,此外也曾经有文献报导固定辅酶时,偶联位置不同,选择性有差别,因此你可以选择自己适合的活化介质。 不同的活化的介质对偶联的配基有不同的要求,所以要对自己的配基了解比较清楚就可以选择合适的活化介质。 我一般在合成的时候大多选择环氧琼脂糖凝胶,它能应用的范围广氨基巯基羟基都可以,而且合成的介质刚性好,非特异吸附少,所以不需要特殊处理未反应基团。此外键合的键很稳定,配基脱落少。我觉得是不错的选择。 
包涵体的蛋白复性做得不多,但是我记得有个哥们说最管用的办法也是最简单的方法,他说在复性的时候尽量别想什么太高难的技术,那些时髦但不一定好用,常用的有透析复性,稀释复性,包括国外的专家也这么说.我觉得有时候开始摸不出来未必就是方法不行,关键要经常改变条件. 层析复性很时髦,但是真正能用的不很多,我觉得蛋白这东西难就在于大多都不相同,所以关键要多看文献,多琢磨自己蛋白的特性,多尝试。
 
 
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